ژنتیک درگیاهان1

چکیده
انتقال ژن یا جذب DNA فرایندی است که قطعه مشخصی از DNA ( معمولاً یک ژن خارجی وارد شده در پلاسمید باکتریایی) را به درون سلول¬ها وارد می¬نماید. در اصلاح نباتات، تکنیک¬های مرتبط با انتقال ژن از طریق تکثیر جنسی و رویشی به خوبی رایج می¬باشند. هدف از این تکنیک¬ها ایجاد تنوع ژنتیکی در جوامع گیاهی، انتخاب گیاهان برتر از نظر ژنهای کنترل کننده صفات مطلوب و همچنین حفظ تنوع واریته¬های گیاهی می¬باشد. با استفاده از تکنیک¬های اصلاحی مرسوم، پیشرفت¬های چشم¬گیری در زمینه بهبود عملکرد گیاهان زراعی حاصل شده است. معذالک این تکنیک¬ها وقت¬گیر هستند. در سالهای اخیر، بیوتکنولوژی گیاهی منبعی سرشار از ابداع و خلاقیت بوده است و برای رفع مشکلات قدیمی راه حل¬های نوینی فراهم کرده است. بنابراین، در این مقاله سعی شده است که چشم¬انداز حال و آینده انتقال ژن را در بهبود گیاهان زراعی مورد بررسی قرار دهد.
قدمه
دهها سال است که انتقال ژن بین گونه¬های گیاهی نقش مهمی در بهبود گیاهان زراعی بازی کرده است. بهبود گیاه چه در نتیجه انتخاب طبیعی و یا با تلاش¬های به¬نژادگران، همیشه بر اساس ظهور، ارزشیابی و گزینش ترکیبات صحیح آلل¬ها بوده است. صفات مفید از قبیل مقاومت به بیماری¬ها، حشرات و آفات از گیاهان غیر زراعی به واریته¬های گیاهان زراعی منتقل شده است. از سال 1970، پیشرفت قابل ملاحظه¬ای در ابداع ابزارهای لازم برای دستورزی اطلاعات ژنتیکی در گیاهان توسط روش¬های DNA نوترکیب رخ داده است. فرایند کلی ترانسفورماسیون ژنتیکی شامل معرفی، تلفیق و بیان ژن یا ژن¬های خارجی در گیاه پذیرنده است. گیاهانی که ژن¬های خارجی از منابع ژنتیکی دیگر را با خود حمل می¬کنند و آنها را به صورت پایدار در خود جای داده و بیان می¬نمایند، گیاهان تراریخت نامیده می¬شوند. تولید گیاهان تراریخت نتیجه کاربرد تلفیقی تکنولوژی rDNA، روش¬های انتقال ژن و تکنیک¬های کشت بافت می¬باشد. با استفاده از این تکنیک¬ها تولید گیاهان تراریخت در محصولات غذایی- لیفی، سبزیجات و درختان میوه و جنگلی میسر شده است. در سالهای اخیر، بیوتکنولوژی گیاهی منبعی سرشار از ابداع و خلاقیت بوده است و برای مشکلات قدیمی راه حل¬های نوینی فراهم کرده است. ژن¬های گیاهی کلون می¬شوند، علائم تنظیم کننده ژنتیکی رمز گشای می¬شوند و ژن¬ها از موجودات کاملاً غیر خویشاوند ( خصوصا باکتریها و ویروسها) برای اعطاء صفات زراعی مفید جدید، به گیاهان زراعی منتقل می¬شوند. ترانسفورماسیون ژنتیکی انتقال ژن¬های مطلوب ویژه را، بدون همراهی با هیچ ژن نامطلوبی از گونه¬های بخشنده به گیاه زراعی میسر ساخته است. در حالیکه در روش¬های اصلاحی مرسوم ژن¬های نامطلوب نیز همراه ژن¬های مطلوب منتقل می¬شوند. پتانسیل وارد کردن و بیان ژنهای خارجی گوناگون اولین بار در گیاه توتون توسط اگروباکتریوم (De Block et al. 1984) و روش بدون استفاده از ناقل (Paszhowski et al. 1984) توصیف شده است. لیست گونه¬های گیاهی که می¬توانند توسط ناقل آگروباکتریوم و روش بدون ناقل تراریخت شوند، به طور مداوم در حال رشد بوده و در حال حاضر توانایی تراریختی به بیش از 120 گونه گیاهی و در حداقل 35 خانواده گسترش پیدا کرده است. موفقیت¬ها اغلب شامل محصولات مهم اقتصادی سبزیجات، گیاهان زینتی، دارویی، درختان و گیاهان مرتعی می¬باشد. انتقال ژن و باززایی گیاهان تراریخت، دیگر جزو فاکتورهای محدود کننده در بهبود و کاربرد سیستم¬های ترانسفورماسیون عملی برای بسیاری از گونه¬های گیاهی نیستند. برای این گفته، کافی است اشاره شود که قبلاً گونه¬های تک لپه¬ای در خارج از حوزه میزبانیA. tumefacims قرار می¬گرفتند و این امر منجر به ابداع انتقال مستقیم DNA یا روش بدون ناقل برای ترانسفورماسیون گردید. معذالک اخیراً ترانسفورماسیون توسط آگروباکتریوم در گونه¬های تک لپه¬ای از قبیل گیاهان غذایی مهم از جمله برنج (Hiei et al. 1994)، ذرت (Ishida et al. 1996) و گندم (Cheng et al. 1997) گزارش شده است.
اولین نسل کاربرد مهندسی ژنتیک در محصولات کشاورزی به سمت تولید گیاهان تراریخت بیان کننده ژن خارجی برای مقاومت به ویروس¬ها، حشرات، علفکش¬ها یا عوامل فساد بعد از برداشت و تجمع فراورده¬های ذخیره¬ای تغییرشکل یافته مفید بوده است. این موضوعات تحت عناوین ذیل بحث شده¬اند.

مقاومت به تنشهای زنده
ترانسفورماسیون ژنتیکی امکان ترانسفورم کردن گیاهان برای بهبود مقاومت به حشرات و پاتوژنها را میسر ساخته است و به سرعت به سمت تجاری شدن پیش می¬رود. این پیشرفت¬ها اساس راهکار اقتصاد پایدار و بدون استفاده از مواد شیمایی را برای کنترل آفات و بیماری¬ها تشکیل می¬دهد. مقاومت به تنش¬های زنده تحت عناوین زیر بحث شده¬اند.
1- مقاومت به حشرات
2- مقاومت به ویروسها
3- مقاومت به بیماریهای قارچی و باکتریایی

1- مقاومت به حشرات
پیشرفت در مهندسی گیاهان تراریخت برای مقاومت به حشره، از طریق استفاده از ژنهای پروتئین کنترل کننده Bacillus thuringiensis حاصل شده است. مقاومت به حشره ابتدا در توتون (Vaeck et al. 1987) و گوجه فرنگی (Fischhoff et al. 1987) گزارش شد. امروزه ترانسژن مقاوم به حشره از هر منبعی از جمله گیاهی، باکتریایی و یا منابع دیگر می¬تواند به منظور افزایش سطح مقاومت به حشره، به گیاهان منتقل شود. تقریباً 40 ژن متفاوت اهدا کننده مقاومت به حشره، به گیاهان زراعی وارد شده است. ژنهای اهدا کننده مقاومت گیاهان به حشره از میکروارگانیسمها بدست آمده است. ژن Bt از Bacillus thuringiensis، ژن ipt ایزوپنتیل ترانسفراز از Agrobacterium tumefacines، ژن کلسترول اکسیداز از قارچهای استرپتومایسز و ژن pht از Photorhabdus luminescens. ژنهای مقاوم از گیاهان عالی می¬تواند به دو گرو تقسیم شود (1) بازدارنده¬های پروتئیناز و آمیلاز و (2) لکتین¬ها، لکتین گل حسرت (GNA)، لکتین نخود، لکتین برنج و غیره. ژن¬های مقاوم با منشاء حیوانی بازدارنده¬های پروتئیناز سرین از پستانداران و کرم شاخدار توتون (Manduca sexta) می¬باشد.

1-1- ژنهای مقاوم از میکروارگانیسمها
ژن توکسین Bt : Bacillus thuringiensis (Bt) باکتری حشره¬کشی است که یک ضد پرتئین تولید می¬کند. ژن¬های Bt، توکسین Bt را کد می¬کنند، که دارای طیف وسیعی از فعالیت حشره¬کشی می¬باشند. اکثر توکسین¬های Bt بر علیه لاروهای بال پولک داران فعال هستند، اما بعضی ها ویژه حشرات راسته دو بالان و قاب بالان هستند. عامل سمیت حشره¬های Bt یک پروتئین بزرگ می¬باشد. توکسین¬ها به صورت پروتئین¬های کریستالی سیکما توکسین (δ-endotoxins) در درون باکتری در خلال اسپورزایی تجمع می¬یابند. این پروتئین¬ها بعد از آلوده کردن حشره حساس، به فرم فعال در می¬آیند و در نتیجه با اختلال در انتقال یون باعث مرگ حشره می¬شوند. چندین ژن که توکسین¬های مؤثر بر بال پولک داران را تولید می¬نمایند، جداسازی شده¬اند. یکی از این ژن¬ها که متعلق به B. thuringinesis زیر گونه Kurstaki HD-1 می¬باشد. ژن¬های شیمری B. thuringinesis kurstaki دارای پروموتور s35 ویروس CaMV و یک توالی کد کننده برای یک پروتئین تغییر یافته کوتاهتر و فعال همانند ژن کامل، سنتز شده و در گیاهان گوجه فرنگی بیان شده¬اند (Fischhoff et al. 1987) مقدار پرتئین حشره¬کش در این گیاهان برای کشتن لاروهای Manduca sexta، Heliothis virescens، Heliothis zea کافی بود. بررسی نتاج گیاهان تراریخت نشان داد که ژن B. thuringinesis kurstaki به صورت یک ژن غالب مندلی تفکیک می¬یابد. ژن سمی دیگر از B. Thuringinesis، نژاد Berlkiner 1715 ،کلون شده است. این ژن یک پرتئین Bt2، 1155 آمینو اسیدی را تولید می¬نماید. آنالیز سطح بیان یک ژن شیمری مبتنی بر Bt2 در گیاهان توتون نشان داد که کیفیت سم و فعالیت حشره¬کشی آن با هم ارتباط دارند (Veack et al. 1987). گیاهان توتون تراریخت در برابر تغذیه لاروهای Manduca sexta محافظت گردیدند. سم Bt برای حشرات مفید، پستانداران و انسان مضر نیست. این ژن به صورت یک ژن غالب منفرد تفرق می¬یابد.
نژادهای Bt دارای تنوع گسترده¬ای از ژن¬های کد کننده اندوتوکسین سیکما (δ-endotoxins) می¬باشند. گزارشات مربوط به کلون کردن و تعیین توالی اولین ژن کد کننده پرتئین حشره¬کش در سال 1981 منتشر گردید. تا کنون بیش از 100 توالی ژن پرتئین کریستالی انتشار یافته است. هریک از پروتئین¬های کریستالی طیف فعالیت خاصی دارد. بعنوان مثال، پروتئین Cry1Ab در برابر کرم ساقه خوار اروپایی ذرت شدیداً فعال است و در هیبریدهای ذرت Bt کنونی مورد استفاده قرار می¬گیرد. پرتئین Cry1Ab برای لاروهای کرم گیاهچه توتون و کرم غوزه پنبه شدیداً سمی است و در واریته¬های پنبه Bt بیان می¬شود و این گیاهان را در برابر سوسک کلورادوی سیب زمینی حفاظت می¬نماید.
سیکما- اندوکسین¬های Bt به هر دو صورت (اندازه کامل) و (کوتاه شده) به گیاهان انتقال داده شده¬اند و مقاومت تائید شدهای را در برابر توتون (M.sexta)، آفات گوجه فرنگی Heliothis ( virescens و Helicovera zea) و آفات سیب زمینی (Phthorimeae operculella) بوجود آورده¬اند. اولین گیاهانی که تولید شدند، قادر به سنتز پروتوکسین (Protoxin) کامل بودند، اما به دلیل بیان ضعیف ژن مقادیر کمی دلتا توکسین تولید می¬شد که حاصل آن عدم بروز مقاومت و یا مقاومت اندک بود. پیشرفتهای بیشتر، سرانجام منجر به مطلوب شدن بیان ژن cry در گیاهان شد. چند سالی است که اولین نسل گیاهان حشره¬کش برای مقاصد تجاری وارد بازار شده است.

1-2- ژن¬های مقاومت منشاء گرفته از میکروارگانیزم¬های دیگر
پروتئین کلسترول اکسیداز (Co) موجود در کشت فیلتر شده Sterptomyces بر لارو شپشک غوزه اثر سمیت حاد دارد. این ژن به گیاهان توتون منتقل گردیده است. ژن ایزوپنتیل ترانسفراز (ipt) Agrobacterium tumefaciens یک آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز سیتوکینین کد می¬نماید. بیان ipt در توتون، گوجه فرنگی توسط یک پروموتور القاء شونده توسط زخم (wound inducible promoter) سبب کاهش تغذیه کرم شاخدار توتون (M. sexta) از برگ¬ها و کاهش بقای شته سبز هلو شده است.


1-3- ژن¬های مقاومت از گیاهان عالی
همچنانکه سموم Bt با موفقیت به درون گیاهان مهندسی می¬شوند، تلاش¬هایی نیز در جهت کشف ژنهای سموم حشره¬کش غیر Bt صورت می¬گیرد. تعدادی از پروتئین¬های حشره¬کش غیر Bt در احتیاجات غذایی حشرات مداخله می¬نمایند. دو گروه عمده از ژنهای با منشاء گیاهی وجود دارد که برای ایجاد مقاومت به حشرات در گیاهان زراعی از طریق به تاخیر انداختن رشد و نمو حشره مورد استفاده قرار می¬گیرند.

1-3-1- بازدارندههای پروتئیناز (Proteinase inhibitors)
از سال 1938 مشخص شده است که گیاهان دارای پپتیدهایی هستند که به عنوان بازدارنده¬های پروتئیناز عمل (PIPs) می¬نمایند. پروتئینازهای مختلف عبارتنداز پروتئینازهای سرین، سیستئین، آسپارتیک و متالو. پروتئینازها آزاد شدن اسیدهای آمینه از پروتئین جیره غذایی را کاتالیز می¬نمایند، و به صورت مواد مغذی ضروری برای رشد و نمو حشرات را تامین می¬نمایند. بازدارنده¬های پروتئیناز با مداخله در عمل آنزیمهای هضمی حشره، آن را از مواد مغذی ضروری محروم می¬سازند. به دو نمونه از ژن بازدارنده پروتئیناز در ذیل به آنها اشاره شده است:

الف) بازدارنده ترپسین لوبیا چشم بلبلی (CpTI) (Cowpea trypsin inhibitor gene)
CpTI که در لوبیا چشم بلبلی (Vigna unguiculata) یافت می¬شود، فعالترین بازدارنده¬ای است که تاکنون شناسایی شده است. این ژن بازدارنده مواد آنتی متابولیتی تولید می¬نماید که سبب محافظت در برابر سوسک ( Callosobruchus maculates)که یک آفت انباری اصلی است، می¬شود. علاوه بر این، این ژن همچنین برای حشرات متعددی از خانواده بال پولکداران (Heliothis virescens)، ( Manduca sexta) قاب بالان (Callosobruchus، Antonomous grandis) و راست بالان (Locusta migratoria) مضر است، اما برای پستانداران بیضر می¬باشد. ژن CpTI کلون شده و ساختارهای حاوی پروموتور S35 ویروس CaMV و یک کلون cDNA با طول کامل bp550 از آن برای تراریخت نمودن دیسکهای برگی توتون مورد استفاده قرار گرفت. آزمایش سنجی برای فعالیت حشره¬کشی گیاهان توتون تراریخت با کرم غوزه پنبه (Heliothis zea) انجام شد. بقاء حشره و میزان خسارت وارده به گیاه، در گیاهان تراریخت در مقایسه با گیاهان شاهد، بطور واضحی کاهش یافت.

ب) بازدارنده آلفا – آمیلاز (α-amylase inhibitor)
سه ژن بازدارنده آلفا- آمیلاز در توتون بیان شده¬اند، اما تاکید اصلی بر روی انتقال ژن بازدارنده آلفا – آمیلاز (AI-Pv) α جدا سازی شده از لوبیا ( Phaseolus vulgaris) بوده است. این ژن بر علیه Zabrotes subfaciatus و Callosobruchus chinesis عمل می¬نماید. این پروتئین بازدارنده آلفا- آمیلاز، تغذیه لاروی را در بخش میانی لوله گوارش را بلوکه می¬نماید. لوله گوارش لارو یک آنزیم آلفا-آمیلاز ترشح می¬کند که نشاسته را هضم می¬نماید. با اضافه کردن یک پروتئین، که آلفا- آمیلاز روده حشرات را متوقف نماید، شپشه دچار گرسنگی شده و می¬میرد.

1-3-2- لکتین¬ها (Lectins)
لکتین¬ها خانواده بزرگ دیگری از پروتئین¬ها هستند که می¬توانند بعنوان سموم ضد حشره برای مهندسی ژنتیک مقاومت به حشرات مورد استفاده قرار گیرد. لکتین¬ها گلیکوپروتئینهای گیاهی هستند. توجهات اخیر بطور عمده بر روی لکتین Galanthus nivalis که به GNA نیز معروف است، متمرکز شده است، زیرا که فعالیت ضد شته از خود نشان می¬دهد. ژن این پروتئین، با موفقیت در مطالعات مهندسی ژنتیک مورد استفاده قرار گرفته و در گونه¬های گیاهی مختلفی همچون سیب زمینی، و گوجه فرنگی بیان شده است. آزمونهای آزمایشگاهی با سیب زمینی تغییر یافته نشان داد که GNA، مرگ و میر را افزایش نمی¬دهد، اما سبب کاهش قابل ملاحظه¬ای در باروری می¬شود. یک ویژگی مهم این پرتئین این است که بر علیه حشرات مکننده و نفوذ کننده نیز عمل می¬نماید. با این وجود، یک عیب آن این است که این پرتئین زمانی خوب عمل می¬کند که به مقادیر فراوانی بلعیده شود، یعنی زمانیکه حشره در معرض مقادیر میکروگرمی این پروتئین در آزمایشات زیست سنجی در جیره غذایی قرار داده می¬شود. بنابراین، اگر چه که چند ژن کد کننده لکتین (آگلوتینین جنین گندم و لکتین برنج ) در گیاهان تراریخت بیان شده¬اند، ولی تاثیر حشره¬کشی آنها بسیار کمتر از آن است که مؤثر واقع شوند.

1-4- ژنهای مقاومت از حیوانات
ژنهای مقاومت مورد نظر ترجیحاً بازدارنده¬های پروتئیناز سرین از پستانداران و کرم شاخدار توتون Manduca sexta می¬باشد. بر اساس غربالگری در این¬ویترو بازدارندگی از پروتئولیز توسط عصاره¬های تعدادی از لاروهای بال پولک¬داران، بازدارنده ترپسین پانکراسی بواین (BPTI)، آلفا- آنتی ترپسین (α.AT) و بازدارنده اسپلین (SI)، بعنوان پروتئین¬های امید بخش مقاومت به حشرات شناسایی و به تعدادی از گیاهان منتقل گردیده¬اند. معذالک نتایج اولیه بر روی بید سیب زمینی در گیاهان سیب زمینی تراریخت، چندان رضایتبخش نیست. اما بازدارنده¬های پروتئیناز گرفته شده از Manduca sexta یعنی آنتی کیمیو ترپسین (Anti-chymiotrypsin) و آنتی الاستاز (Anti- elastase) بیان شده در پنبه و کتیناز (Chitinase) در توتون، تولید مثل را به ترتیتب در Bemisia tabaci و Heliothis virescens کاهش دادند، تعدادی از ژنهای عامل مقاومت به حشرات که برای تولید گیاهان تراریخت مورد استفاده قرار گرفته¬اند.

2- مقاومت به ویروس
به دلیل اندازه نسبتاً کوچک ژنوم ویروس¬های گیاهی، توسعه راهکارهای مولکولی برای کنترل بیماریهای ویروسی گیاهی به طور خاص موفق بوده است. راهکارهای مختلفی برای استفاده از تکنولوژی مولکولی به منظور تلفیق یا ایجاد فاکتورهای مقاومتی جدید در سیستمهای ویروسی گیاهان وجود دارد. روال کار به این نحو است که¬آن دسته از محصولات ژن یا ژنهای ویروسی شناسایی شوند که وقتی در زمان نامناسب یا با مقدار نادرست وجود دارند، با کارکردهای نرمال فرایند آلودگی مداخله نموده و مانع از پیشرفت بیماری شوند.

2-1- حفاظت متقاطع به واسطه پروتئین پوششی
مفهوم حفاظت متقاطع به توانایی یک ویروس برای جلوگیری یا بازدارندگی اثر رقابتی ویروس دیگر اطلاق می¬شود. اگر نژاد حساس از یک گیاه زراعی با نژاد ملایمی از یک ویروس تلقیح شود، نژاد حساس گیاه زراعی نسبت به نژادهای بیماریزاتر ویروس مقاوم می¬شود. برای اولین بار پاول آبل و همکاران (1986) نشان دادند که توتون تراریخت بیان کننده پروتئین پوششی ویروس موزائیک توتون (TMV) مقاومتی شبیه به مقاومتی که در حفاظت متقاطع به واسطه ویروس اتفاق می¬افتد، نشان می¬دهد. از آن زمان به بعد، تعدادی از ژنهای پوشش پروتئینی از گروههای ویروسی متفاوت پیدا شده¬اند که وقتی در گیاهان تراریخت بیان می¬شوند، مقاومت ایجاد می¬کنند. مقاومت به واسطه پروتئین پوششی در صورت کاهش تعداد مناطق آلودگی روی برگهای تلقیح شده عمل می¬کند، بیانگر این که یک مرحله اولیه در سیکل زندگی ویروس مختل شده است.
مطالعات نشان داده است که حفاظت متقاطع TMV ممکن است از پروتئین پوششی ویروس محافظت کننده ناشی شود که مانع از حذف پوشش از RNAهای ویروس رقیب می¬شود. اکثر سیستمهایی که در آنها مقاومت به واسطه پروتئین پوششی گزارش شده است، بر علیه ویروسهای RNAای پلاس- سنس با یک پروتئین کپسید بوده است. این راهکار در چند محصول زراعی از قبیل توتون، گوجه فرنگی، سیب زمینی، یونجه، هندوانه، کدو، برنج، ذرت و غیره استفاده شده است .
یک ویروس رشته منفی مهم، ویروس پژمردگی لکه¬ای گوجه فرنگی (Nucleocapsid protein) پیوند خورده است. این پرتئین در بسته¬بندی RNA ویروسی و همچنین در تنظیم مراحل رونویسی تا همانندسازی در طی سیکل آلودگی، فعالیت می¬نماید. با استفاده از این روش گیاهان تراریخت در توتون و گوجه فرنگی تولید شده¬اند.

2-2- مقاومت به واسطه پروتئین غیر ساختمانی (Non-structural protein mediated resistance)
ویروس¬ها، پروتئینهای غیر ساختمانی را کد می¬کنند که برای همانند سازی ضروری می¬باشند. اخیراً تعدادی از این پروتئینهای غیرساختمانی رپلیکاز (Replicase) کشف شده است که وقتی در گیاهان تراریخت بیان می¬شوند، درجات بالایی از مقاومت به آلودگی ویروس را ایجاد می¬نمایند. گلمبوسکی (Golemboski) و همکاران در سال 1990، برای اولین بار این پدیده را به بیان چهارچوب قرائت باز 54 کیلو دالتونی ویروس TMV در توتون تراریخت نشان دادند. توتون تراریخت مقاوم به قهوه¬ای شدن زودرس (PEBV) و سیب زمینی مقاوم به ویروس x (PVX) تولید شد.

2-3- مقاومت به واسطه سنس (sense) و آنتی سنس (Antisense)
استراتژی دیگر الگو گرفته از پاتوژن که برای کنترل ویروس¬های گیاهی مورد بررسی قرار گرفته است، بیان ترانسژن آنتی سنس و جدیداً قطعات سنس RNAهای ویروسی می¬باشد. اساس این راهکار، اتصال RNAی ویروسی با توالی های RNA مکملی است که توسط گیاه بیان می¬شوند. جفت شدن نامناسب RNA-RNA، از در دسترس بودن RNA ویروسی برای همانند سازی و بیان ژن، ممانعت می¬نماید. بنابراین ساختارهای آنتی سنس و سنس می¬توانند برای بلوکه کردن مراحل اولیه مهم که در ایجاد آلودگی ویروسی مهم هستند، مورد استفاده قرار گیرند. حفاظت آنتی سنس، در توتون که RNAی مکمل پروتئین پوششی ویروس را بیان می¬کند نشان داده شده است.

2-4- حفاظت با RNAی ماهواره¬ای (Satellite RNA protection)
RNAهای ماهواره¬ای، گروهی از RNAهای تک رشته¬ای کوچک (تقریباً 300 نوکلئوتید) هستند که برای همانندسازی و بسته¬بندی ویریونی به منظور ایجاد آلودگی در جای دیگر، به یک ویروس هم دست (Virus Helper) وابسته می¬باشند. بنابراین RNAی ماهواره¬ای برای تکثیر و انتقال به ویروس وابسته است، اگرچه وابسته به ژنوم ویروس نیست. این گونه RNA ماهواره¬ای با چندین ویروس دیگر مرتبط هستند. تعدادی از RNAی ماهواره¬ای تکثیر و علایم ویروس هم¬دست خود را تعدیل می¬نمایند. بسته به RNAی ماهواره¬ای مرتبط، طیف تغییر در ایجاد علایم از نکروز شدید تا کم اثر شدن کامل آن می¬باشد. بنابراین RNAهای ماهواره¬ای که علایم را تقلیل می¬دهند می¬توانند بطور بالقوه برای کاهش شدت بیماری ویروس یاریگر مورد استفاده قرار گیرند. بدین جهت، کاربرد آن در گیاهان تراریخت برای ایجاد مقاومت در گیاهان زراعی از جایگاه مهمی برخوردار گردیده است. تاین و همکاران (1987) و تاین و گوسوی (1991) نشان دادند که تلقیح عمدی یک نژاد ملایم ویروس موزائیک خیار (CMV) حاوی یک RNAی ماهواره¬ای تقلیل دهنده علائم، گیاهان توتون، فلفل، گوجه فرنگی و خیار را بطور موفقیت آمیزی در برابر یک نژاد بیماریزای CMV محافظت نمود و میزان خسارت را کاهش داد.
تاین و گوسوی (1991) گزارش کردند که 121 گیاه گوجه فرنگی تراریخت بیان کننده یک RNAی ماهواره¬ای تقلیل دهنده علائم CMV، در مقایسه با گیاهانی که یک نژاد قوی CMV به آنها تزریق شد، 50% عملکرد بیشتری تولید کردند. این راهکار مربوط به آن دسته از سیستم¬های ویروسی است که دارای RNAی ماهواره¬ای تقلیل دهنده هستند. کلن و همکاران (1997)، فلفل¬های قرمزی (Capsicum annum) تولید کردند که RNAی ماهواره¬ای CMV را بیان می¬نمودند. کاهش علائم آلودگی ویروسی در نتاج این گیاهان، پس از تلقیح با نژادهای CMV-Y یا CMV-Korea، تائید گردید.

3- مقاومت به بیماری
تا کنون تعداد زیادی از ژن¬های پاسخ دفاعی گیاهان که پروتئین¬های ضد میکروبی را کد می¬نمایند، کلون شده¬اند. اکثر این ژن¬ها در پاسخ به آلودگی و یا در مواجهه با ماکرومولکول¬های میکروبی در سطح نسخه¬برداری فعال می¬شوند. فراورده¬های ژن¬های پاسخ دفاعی می¬تواند شامل (1) آنزیم¬های هیدرولیتیک نظیر کتیناز، 1,3,β-D glucanase و دیگر پروتئین¬های مرتبط با بیماریزایی (PR) (pathogenesis related protein)، (2) پروتئین¬های غیرفعال کننده ریبوزوم (RIPs)، (3) پروتئین¬های ضد قارچ ( AFPs)، (4) آنزیم¬های بیوسنتزی برای تولید فیتوالکسین های ضد میکروبی، (5) فنولیکهای متصل به دیواره، اسموتین¬ها (osmotins)، تیونین¬ها(thionins) و (6) پراکسید هیدروژن، باشد.

3-1- پروتئینهای مرتبط با پاتوژن
این پروتئین¬ها دارای وزن مولکولی کم بوده و به مقادیر قابل توجهی در بافت¬های گیاهی آلوده تجمع می¬یابند. گروه¬های اصلی پروتئین¬های PR عبارتنداز PR-1، PR-2 ( 1و3- بتا گلوکاناز)، PR-3 (کیتینازها)، PR-4 (شبه Heveine) و PR-5 (اسموتین و شبه تائوماتین) در توتون. برای ایجاد مقاومت به پاتوژن¬ها در گیاهان زراعی از توانایی آنزیم¬های هیدرولیزکننده در شکستن کیتین و گلوکان دیواره سلولی قارچهای پاتوژن استفاده شده است.
ژن¬های کیتیناز متعددی از گیاهان جداسازی شده و توصیف گردیده¬اند. اولین گزارش در توتون بود که یک ژن کیتیناز باکتریایی بدست آمده از باکتری خاکزی Serratina marcescens، بطور پایدار تلفیق و در برگهای توتون بیان گردید (Jones et al. 1988). یک ژن کیتیناز اصلی از Phaseolus vulgaris تحت کنترل پروموتور ساختمانی قوی s35 ویروس CaMV، بطور ساختمانی و به مقدار زیاد در گیاهان تراریخت توتون و Brassica napus بیان شد (Broglie et al. 1991). این بیان، منجر به حفاظت قابل ملاحظه گیاهان از قارچ پاتوژن Rhizoctonia solani گردید که باعث مرگ گیاهچه پس از جوانه زنی می¬شود. در مورد B.napus، اگر چه حفاظت مدنظر به صورت تاخیری بود تا ممانعت کامل از بروز علائم، با این حال نتایج بدست آمده نشان داد که سطح حفاظت به اندازهای هست که از اهمیت افتصادی در شرایط مزرعه برخوردار باشد.
هیچ گزارشی در مورد افزایش مقاومت ناشی از بیان ژن 1-3-β-D-glucanase به تنهایی در گیاهان تراریخت وجود ندارد، اما ژن گلوکاناز وقتیکه با کیتیناز همراه می¬شود، مقاومت به قارچ را در توتون، گوجه فرنگی و هویج نشان می¬دهد.

3-2- پروتئین¬های ضد میکروبی (Anti-microbial proteins)
گیاهان و دیگر موجودات ممکن است دارای پروتئین¬های ضدمیکروبی باشند که ضرورتاً در ارتباط با پاسخ دفاعی القا شده نیستند، اما وجود این پروتئین¬ها سبب بروز مقاومت به پاتوژن¬ها می¬شود.این پروتئین¬ها شامل پروتئین¬های غیرفعال کننده ریبوزوم (RIPs)، پروتئین¬های غنی از سیستئین مانند لکتین¬ها، دفنسین¬ها، تیونین¬ها، لیزوزایم، بازدارنده¬های پلی گالاکتوروناز و غیره می¬باشد. گیاهان تراریخت مقاوم به پاتوژن¬ها در گونه¬های متعددی تولید شده¬اند.

3-3- فیتوالکسین¬ها
فیتوالکسن¬ها، متابولیت¬های ثانویه¬ای با وزن مولکولی کم و با فعالیت ضد میکروبی هستند که توسط گیاهان در پاسخ به یک آلودگی سنتز می¬شوند و در مقاومت گیاهان به بیماری سهیم می¬باشند. در طی آلودگی، فیتوالکسین¬ها ذخیره شده ( معمولاً در سلول یا اندامک¬های خاص ولی به فرم کانژوگه غیرفعال وجود دارند) به جنبش در آمده و همزمان ژن¬های مسیرهای بیوسنتزی آنها فعال می¬شوند و سنتز فیتوالکسین¬های بیشتری شروع می¬گردد. رسوراتزول (Resveratoral) یکی از معمول¬ترین استیلبن¬ها (Stilbene) (فیتوالکسین¬ها) است که در بعضی از گونه¬ها سنتز می¬شود. آنزیم اصلی در سنتز رسوراتزول، آنزیم رسوراترول سنتاز (Resveratrol synthase) است که غالباً به استیلبن سنتاز (Stilbene synthase) معروف می¬باشد.
هین و همکاران (1990) نشان دادند که انتقال یک ژن استیلبن سنتاز (STS) از بادام زمینی به توتون سبب تولید مقادیر قابل اندازه¬گیری از رسوراترول استیلبنی بادام زمینی در توتون می¬شود و اثر سمیت ضدقارچی رسوراترول در گیاهان را اثبات نمودند. ژن STS به برنج و Brassica napus نیز منتقل شده است.

3-4- دستورزی ژن¬های مقاومت به بیماری
تلاش¬ها در زمینه جداسازی ژن¬های مقاومت به بیماری، به لطف توسعه روش¬های کلونینگ مبتنی بر نقشه وعلامتگذاری ژن در چند سال گذشته به پیشرفت قابل توجهی نائل گردیده است. ژن HM1 ذرت، که مقاومت به Cochliobulus carbonum اعطا می¬کند با استفاده از علامت¬گذاری ترانسپوزون (transposon tagging) کلون شده است (Johal and Briggs 1992). این ژن آنزیم HC- توکسین رودکتاز (HC-toxin reductase) وابسته به NADPH را کد می¬نماید که سم قارچی HC را غیرفعال می¬سازد. ژن¬های مقاومت نظیر RPs2 و RPM1 از آرابیدوپسیس، Pto،Cf9، Cf4 و Cf2 از گوجه فرنگی، ژنN توتون، L16 کتان و Xa21 برنج کلون شده¬اند. تعدادی از ژن¬های غیربیماریزا شامل Avr9، Avr4 و غیره نیز کلون گردیده¬اند.
انتقال ژن مقاومت (R) از یک واریته گیاهی مقاوم به یک پاتوژن خاص به واریته حساس، یک راهکار اصلاحی است. مارتین و همکاران (1993)، گیاهان گوجه فرنگی با ژن مقاومت Pto تولید نمودند که به seudomonas syringae pv. tomato مقاومت ایجاد می¬نماید. گیاهان توتون تراریخت برای Pto، به Pseudomonas syringae pv. tabaci بیان کننده avrPto مقاوم شدند. ژن Xa21 برنج به بیش از 30نژاد مختلف باکتری Xanthomonas oryzae عامل بادزدگی برگ برنج مقاومت ایجاد می¬نماید. سانگ (Song) و همکاران (1995) گیاهان تراریخت برنج مقاوم به Xanthomonas بیان کننده avrX21 را تولید نمودند.

مقاومت به تنش¬های غیرزنده
تقریباً تمام تنش¬های غیرزنده نظیر خشکی، سرما و شرایط قلیایی اثر منفی بر رشد داشته و سبب القاء پیری، مرگ سلولی و یا کاهش عملکرد گیاه می¬شوند. تعدادی از تنش¬های غیرزنده همچون خشکی، شوری و دمای خیلی بالا و یا خیلی پائین درای پیامد مشترکی یعنی کمبود آب سلولی و یا تنش اسمزی می¬باشد. از این¬رو، پاسخ گیاهان به کمبود آب، سنتز و تجمع ترکیباتی با وزن مولکولی کم بنام حفاظت کننده¬های اسمزی (Osmoprotectants) است. این حفاظت کننده¬های اسمزی، پتانسیل اسمزی درون سلول¬ها را کاهش داده و به حفظ تورژسانس سلولی کمک می¬نمایند. محلول¬های سازگار شامل گروه متنوعی از ترکیبات متعددی از قبیل یونهای غیرآلی، یونهای آلی، کربوهیدراتهای محلول شامل پلی ئولها (Polyols) ( قندها، الکلها)، اسیدهای آمینه (پرولین) و ترکیبات آمونیوم چهارگانه نظیر گلایسین بتائین را در بر می¬گیرند. چندین ژن گیاهی که آنزیم¬های کلیدی مسیرهای بیوسنتزی اسمولیت¬هایی همچون الکلها، قندها، گلایسین بتائین و پرولین را کد می¬نمایند کلون شده¬اند.
همبستگی شدیدی بین تجمع پرولین با تحمل به شرایط تنش خشکی و شوری گزارش شده است. گاما- پیرولین- 5- کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) (γ-pyrroline-5- carboxylate synthethase)، آنزیم محدود کننده سنتز پرولین است. گیاهان توتون تراریخت با آنزیم P5CS تولید شدند که بیان بالایی از این آنزیم و 18-10 برابر پرولین بیشتر را نشان دادند. افزایش غلظت پرولین با افزایش رشد در شرایط خشکی و شوری همبستگی داشت (Kishore et al. 1995). توانایی سنتز و تجمع گلایسین بتائین یکی از قابلیت¬های گسترده بازدانگان است که در تحمل به خشکی و شوری نقش دارد. سنتز گلایسین بتائین در گیاهان توسط اکسیداسیون دو مرحله¬ای کولین (Choline) از طریق بتائین آلدئید ( ماده واسط) صورت می¬گیرد. این واکنش توسط کولین مونواکسیژناز (CMO) (Choline monooxygenase) و بتائین آلدئید دهیدروژناز (BADH) کاتالیز می¬شود. گیاهان تراریخت توتون، آرابیدوپسیس و برنج با BADH، افزایش مقاومت به شوری را نشان دادند. یک ژن باکتریایی E.coli بنام mt1D که در بیوسنتز مانیتول سهیم است به توتون انتقال داده شد و گیاهان تراریخت تولید کننده مانیتول، ارتفاع ساقه بیشتر و انشعابات ریشه¬ای جدید و طویل¬تری داشتند، در حالیکه ریشه¬های گیاهان شاهد قهوه¬ای شده و طویل شدن یا منشعب شدن در آنها رخ نداد. اگرچه بهبود مقاومت در حدی نبود که قابل کاربرد در کشاورزی باشد، ولی این اولین مثال از یک گیاه تراریخت با ژن میکروبی بود که مقاومت بیشتری را به تنش¬های اسمزی نشان داد ( Traczynski et al. 1993). تغییر دیگری در مقاومت به تنش اسمزی، در گیاهان توتون مهندسی شده برای بیان یک ژن باکتریایی که در بیوسنتز فروکتان (Fructan) نقش دارد، گزارش شده است (Pilons-Smith et al. 1995). گیاهان تراریخت ذخیره کننده فروکتان، وقتی¬که با تنش خشکی با استفاده ار 10% PEG در کشت هیدروپونیک مواجه گردیدند، سرعت رشد سریعتری را نشان دادند. تنش اسمزی، تجمع مجموعه¬ای از پروتئینهای با وزن مولکولی کم بنام پروتئین¬های محافظ (Dress proteins) نظیر LEAها را در بافت¬های گیاهی تحریک می¬نماید. یک ژن lea از جو بنام HVAI حفاظت از تنش را در برنج تراریخت نشان داد (Xu et al. 1996).

مقاومت به علفکش
کاربرد علفکش¬ها برای کنترل علفهای هرز در کشاورزی مدرن نقش بسزایی دارد. تلاش¬های زیادی در چندین آزمایشگاه برای مهندسی گیاهان مقاوم به علفکش صورت گرفته است. در مقاومتی که توسط یک ژن کنترل می¬شود پیشرفت حاصل شده است. برای ایجاد گیاهان مقاوم به علفکش سه راهکار مورد استفاده قرار گرفته است: (1) تولید بیش از حد هدف بیوشیمیایی حساس به علفکش، (2) تغییر ساختمانی هدف بیوشیمایی بطوری که منجر به کاهش اثر گذاری علفکش شود و (3) سمیت زدایی و تجزیه علفکش قبل از رسیدن آن به هدف بیوشیمیایی درون سلول گیاهی

منبع:وبلاگ گیاهشناسی