مهندسی ژنتیک

مهندسی ژنتیک :

مهندسی ژنتیک ، شامل تکنیکهایی مانند جداسازی ، خالص سازی ، وارد کردن و تظاهر یک ژن خاص در یک میزبان می‌باشد که نهایتا منجر به بروز یک صفت خاص و یا یک محصول مورد نظر می‌شود.

چند مورد از کاربرد های مهندسی ژنتیک :

ژن درمانی  :

• تا کنون صدها بیمار تحت مداوای ژن درمانی قرار گرفته‌اند. محققین راههای دستیابی به ژن درمانی سلولهای بدن را توسعه داده‌اند. رایجترین تکنیک Exvivo Thraphy شناخته شده است. در این روش یا ژن معیوب برداشته می‌شود و یا ژن سالم وارد کشت سلولی می‌شود. در این روش درمانی ، معمولا سلولهای خونی مورد نظر هستند. زیرا بسیاری از عیوب ژنتیکی عملکرد یکی از انواع این سلولها یا سایر سلولها را تغییر می‌دهند. تلاشهای امروزه متوجه سلولهای مغز استخوان است آنها سلولهای ناقص هستند که باعث تشکیل سلولهای خونی در جریان گردش خون می‌شوند. و فناناپذیر هستند.

• راه دیگر ژن درمانی ، استفاده از ژن در محل معین می‌باشد (Insitu). مثلا تزریق ژن سالم در عضله حیواناتی که دارای سوء تغذیه عضلانی هستند. این روش هنوز ناتوان است ولی برای درمان سرطان به کار گرفته شده است ولی چون ژنها بطور اتفاقی به داخل DNA کروموزومها راه می‌یابند، می‌توانند مصون باشند و عواقب شدیدی داشته باشند. برای مثال اگر ژنهای سالم ، ژنهای محافظ تومور را که معمولا از بدن در برابر تومورها ، حفاظت می‌کند، از بین ببرند، نتیجه آن سرطان خواهد بود.

• برای انتقال ژن به سلول یوکاریوت از روشهای مختلف مانند پودر طلا ، کلسیم ، ویروس و لیپوزومها استفاده می‌شود. لیپوزومها غشاهای لیپیدی شبیه به غشاء سیتوپلاسمی حاوی ذره DNA می‌باشند که جذب سلولها می‌شوند.

انتقال ژنها به درون سلولهای پستانداران  :

• Ca⁺² ، جذب DNA توسط سلولهای مهره داران را تحریک می‌کند: مکانیزم جذب DNA مخلوط با Ca⁺² توسط سلولها ، واضح نیست. اما حقیقت این است که سلولهای فوق دانه‌های ریز DNA را فاگوسیتوز می‌کنند و بعدها بخش کوچکی از مولکول DNA بطور ثابت در درون DNA کروموزومی سلولها ادغام می‌شود. از آنجایی که فقط بخش بسیار کوچکی از DNA اضافه شده سرانجام بطور عملی به درون DNA سلولی ادغام می‌شود. تکنیکهای نشانگر باید پیشرفت کنند تا سلولهایی که دارای DNA ادغام شده هستند، بطور انتخابی تکثیر شوند و در برابر سلولهای تغییر نیافته شناسایی شوند.

• تیمیدین کیناز (TK) به عنوان نشانگر انتخابی در یوکاریوتها: بهترین مارکر شناسایی شده تا کنون ژن تیمیدین کیناز می‌باشد. این آنزیم در مسیر بیولوژیکی بیوسنتز پیریمیدین استفاده می‌شود. آنزیم فوق تیمیدین را که بوسیله تجزیه DNA تشکیل شده است می‌گیرد و آنرا به صورت دزوکسی تیمیدین مونوفسفات فسفریله می‌کند که با اضافه کردن دو گروه فسفریله نشده یا زنده ماندن سلولها ضروری نیست و سلولهایی که کاملا فاقد این آنزیم هستند، زنده می‌مانند.

• ریز تزریق DNA به درون سلولهای پستانداران: گذشته از اینها ، DNA می‌تواند با استفاده از یک میکرو پیپیت شیشه‌ای با قطر 0.1 میکرون و از طریق تزریق مستقیم خود به درون هسته‌های سلولها ، بطور ثابت به درون سلولهای کشت بافت وارد شود چنین روشی نیازمند تجهیزات پیچیده‌ای است، اما با اینحال یک شخص می‌تواند به 500 - 1000 سلول در هر ساعت DNA تزریق کند و باعث شود که 50 درصد از سلولهای تزریق شده به طرز ثابت ژنهای تزریق شده را ادغام کرده و آن را بیان کنند. برتری این روش این است که اصولا هر قطعه‌ای از DNA می‌تواند به درون هر سلولی وارد شود و هر سلول تغییر یافته مشخص است و هیچ مارکری برای انتخاب لازم نیست.

برقراری حضور ژنهای خاص سرطانی انسان بواسطه آزمایشات انتقال ژن  :

      تکنیک مخلوط کردن با Ca⁺² برای انتقال ژن ابتدا برای DNA ویروس توموری استفاده شد تا سلولهای 

نرمال پستانداران را به سمت فنوتیپ بدخیم وسرطانی تغییر شکل دهد. اخیرا تکنیکهای انتقال ژن برای شناسایی و کلون کردن ژنهایی بکار رفته است که در تشکیل سرطانهای انسان دخالت دارند.این آزمایشات با این یافته آغاز شد که DNA با وزن مولکولی بالا از سلولهای موش که بطور شیمیایی دگرگون شده بودند و یا از کشتهای سراطانهای انسانی ، جداسازی شد و این DNA توانست فیبروبلاستهای طبیعی سلولهای فیبروبلاستی طبیعی موش ، اضافه شد. سلولهای تیمار شده به مدت چندین هفته در یک محیط کشت حاوی سرم گذاشته شدند و پس از آن ، کانونهای کوچکی از سلولهای سرطانی ، آشکار شد. با تزریق این سلولها به موش ، موش دچار سرطان شد.

 

تولید حیوانات ترانس ژن    :           

:                                      

• تولید موشهای با جثه بزرگ ، انتقال بیماری انسان به موش ، تولید گوسفند با شیر و پشم فراوان و تولید خوک با جثه بزرگ از هدفهای تولید حیوانات ترانس ژن می باشد. اکثر حیوانات ترانس ژن ، موش می‌باشد. چون هم تخمک و هم فرزند فراوان تولید می‌کند، برای انتقال ژن به درون تخمک موش ، تخمک را با پیپت مخصوص متصل به خلاء نگهداری می‌کنند و با سوزن ریز DNA وارد هسته می‌کنند. تخمک تغییر یافته را به موش انتقال می‌دهند.

• برای تولید گاو و گوسفند ترانس ژن ، نمی‌توان مانند روش موش پیش رفت. برای تولید گوسفندان با پشم فراوان ژن سنتز سیستئین (نوعی اسید آمینه) باکتری را در شبکه حیوان وارد کرده و در سیرابی SH₂ و اسید آمینه متیونین به دام افتاده و سیستئین سنتز می‌شود. سیستئین باعث سنتز راتین شده و این حیوانات پشم زیادی تولید می‌کنند. گاوهای ترانس ژن قادر به تولید انترفرون می‌باشند.

• شاید حیوانات ترانس ژن هورمون و شیر زیاد تولید کنند، ولی مستعد به عفونت می‌باشند. و فاقد فاکتور انعقاد خون هستند. اکثرا نازا می‌باشند و در جوانی گرایش به مرگ دارند. آزمایشات در مورد تولید خوکهای ترانس ژنی که جثه بزرگ دارند نشان داده است که آرتریت ، التهاب قلب ، زخم معده و حساسیتهای پوستی در آنها زیاد است. بنابراین این سوال مطرح است که آیا پشم زیاد گوسفند از نظر اقتصادی با عمر کوتاه او برابری می‌کند؟

 PCR             ( Polymerase  chain  reaction     )

PCR ، حالتی از همانند سازی DNA می باشد :

      در این روش با استفاده از اجزای همانند سازی طبیعی ، DNA در داخل لوله ی آزمایش تکثیر می شود .ابتدا رشته های DNA الگو با استفاده از حرارت از هم جدا می شوند ، که این فرایند تقلیب( Denaturation ) نام دارد .پرایمر های اولیگو نوکلئوتیدی توالی های مکمل خود را بر روی DNA الگو پیدا خواهند کرد . ( اتصال annealing ) و نهایتاً DNA پلی مراز اضافه کردن دی اکسی نوکلئوتید ها را بر روی پرایمر ها آغاز می نماید و ملکول های جدید از روی هر دو رشته تشکیل می شوند . در مرحله ی حرارت دهی بعدی ، این رشته های تازه ساز مجدداً از هم جدا می شوند و تمامی رشته های جدا شده ( هم رشته های اولیه و هم رشته های تازه ساز ) جایگاه اتصال برای پرایمر ها فراهم می سازند و به عنوان الگو برای ساخت رشته های DNA بعدی عمل می کنند . در این مرحله DNA با طول مشخص ( در واقع محصول PCR ) به دست خواهد آمد .سپس افزایش تعداد نسخه های توالی DNA هدف به صورت تصاعدی ادامه می یابد . در واقع رشته های هدف در هر چرخه دو برابر خواهد شد ، یعنی در صورت کارایی 100% از هر نسخه DNA موجود در ابتدای واکنش تنها پس از 20 چرخه تعداد 1000000 نسخه محصول ساخته خواهد شد .البته کارایی واکنش هیچ گاه 100% نخواهد بود .

PCR ، از طریق سرد و گرم کردن کنترل می شود :

    اساس PCR استفاده از دماهای مختلف در سه مرحله ی واکنش ، تقلیب ( denaturation ) ، اتصال (annealing ) و طویل شدن ( extension ) می باشد . یک دمای بالا معمولاً 95 – 94 درجه ی سانتی گراد برای جدا کردن رشته های DNA الگو به کار برده می شود .سپس دما جهت اتصال پرایمر ها به توالی های مکمل بر روی رشته های الگو پایین آورده می شود ، که این دما بستگی به پرایمر های مورد استفاده دارد .نهایتاً برای ساخت DNA با کارایی زیاد ، دما در حد دمای بهینه ی فعالیت DNA  پلی مراز تنظیم می گردد . جهت تکثیر DNA هدف لازم است که این دما طی چندین چرخه ( 30 – 25 چرخه بسته به نوع کاربرد ) تکرار شوند ، که این کار توسط ترمو سایکلر انجام می شود . این دستگاه قابل برنامه ریزی است و می تواند دما را به سرعت تغییر دهد و لوله های آزمایش را در دماهای مورد نظر با مدت زمان مشخص نگهداری نماید . ساخت این دستگاه های خود کار یکی از مهم ترین پیشرفت ها در زمینه ی PCR می باشد .قبل از ساخت این دستگاه PCR با استفاده از سه حمام آب گرم انجام می شد .

کاربرد های PCR  :

     با این روش می توان DNA موجود در 50 گلبول سفید را که در یک لکه ی بسیار کوچک خون یافت می شود ، تکثیر نمود .این روش برای تشخیص بیماری ها و ناهنجاری های ژنتیک و حل مسائل جنایی اهمیت دارد . هم چنین در زمینه های مختلف تحقیقاتی و برای مطالعه ی قطعات DNA اجدادی در فسیل ها یا مواد حفظ شده نیز به کار می رود .

zeraat85-sari.blogfa.com/