کشت بافت و کاربرد آن در داودی

1- تکثیر از طریق کشت بافت

1-1- محیط کشت و ریزنمونه

برای تهیه ریز نمونه در داودی از برگهای جوان نیمه باز با رنگ سبز روشن به طول 5-2 سانتی متر استفاده شده است. ضد عفونی کردن برگهای رشد یافته در شرایط گلخانه با هیپوکلریت سدیم 5% حجمی/ حجمی به مدت 5 تا 10 دقیقه و ضد عفونی کردن برگهای گیاهان رشد کرده در شرایط مزرعه با هیپوکلریت سدیم 10% حجمی/ حجمی انجام گردید.
ریز نمونه هایی به اندازه 2/1-1 سانتی متر مربع از قطعات برگی یا تک گره تهیه می شوند. محیط کشت پایه استفاده شده شامل MS پایه (Murashige and Skoog, 1962) با نمکهای پایه به اضافه 30 گرم در لیتر ساکارز، 1 گرم در لیتر میوانیوسیتول، 5 میلی گرم در لیتر تیامین HCl و همراه با 8 گرم در لیتر آگار و 7/5=pHمی باشد محیط کشت استریل شده در پتری های 15 * 60
میلی متری توزیع می شود. تنظیم کننده های رشد با توجه به هدف آزمایش تهیه و در محیط کشت اضافه می شود.
باززایی شاخساره های نابجا از کالوس های حاصل از ریز نمونه های برگ و ساقه دو رقم تجاری داودی به نامهای Chrysanthemum morifolium cv. Brietner (بنفش چوب بستی) و Chrysanthemum morifolium cv. Marion (کرم) در دو نوع محیط رشد مورد مطالعه قرار گرفت. محیط رشد باززایی هر دو رقم، محیط پایه MS به همراه هورمون NAA (1/0 تا 25/0 میلی گرم در لیتر) و BA (2 میلی گرم در لیتر) در نظر گرفته شد. نتایج نشان داد در بیشتر موارد درصد باززایی ریز نمونه ساقه نسبت به برگ (در هر دو رقم) بیشتر بوده است. رشد و ریشه دهی گیاهچه های حاصل از باززایی هر دو رقم بطور همزمان در محیط MS انجام گرفت. بیشترین میزان تولید کالوس از ریزنمونه های برگ به طول 5/1 – 2 سانتیمتر روی محیط MS حاوی 5 میلی گرم BAP و 5/0 میلی گرم در لیتر کینتین بدست آمد. در محیط MS حاوی 2/0 میلی گرم در لیتر IBA ریشه زایی به میزان 100% صورت گرفت.
باززایی شاخساره از قطعات گره (Nodal segment) و نوک شاخساره (Shoot tip ) به ترتیب در محیط MS حاوی 0/1 میلی گرم در لیترBAP و ریشه زایی در محیط MS حاوی 2/0 میلیگرم در لیتر IBA به میزان 95% و 91% موفقیت آمیز بوده است.
از نوک شاخساره و قطعات تک جوانه نیز برای تکثیر سریع داودی استفاده شده است. بیشترین میزان تکثیر در محیط MS حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز و 0/1 میلی گرم در لیتر BAP، 2/0 میلیگرم در لیتر NAA و 10 میلی گرم در لیتر اسید جیبرلیک حاصل شده است. ریشه زایی در زمان کوتاهی ( حدود 5 روز) روی محیط MS حاوی 0/1 میلیگرم در لیتر IAA صورت می گیرد.
همچنینازدیاد داودی از طریق کشت مریستم انتهایی نیز بر روی محیط MS حاوی Kin (2-0 میلی گرم در لیتر)، NAA (2-0 میلی گرم در لیتر) به تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر مورد بررسی قرار گرفت و نتایج این بررسی نشان داد که بیشترین وزن تر کالوس (2096 میلی گرم در هر لوله آزمایش) در غلظت 1 میلی گرم در لیتر NAA به همراه 5/0 میلی گرم در لیتر Kin حاصل می شود، در حالی که در کشتهای فاقد هورمون وزن تر کالوس 20 میلی گرم ارزیابی گردید. اگر چه تمایز ریشه و شاخساره در محیطهای حاوی NAA و یا Kin وجود دارد. ولی با این حال در محیطهای حاوی هورمون NAA تمایز ریشه و در محیطهای حاوی Kin سرعت رشد شاخساره بهترمی باشد. آزمایشات نشان داده که ریز نمونه های ساقه و برگ داودی نسبت به هورمون NAA در مقایسه با هورمون BAP حساسیت و واکنش بیشتری نشان می دهند. بالاترین درصد باززایی شاخساره از گلچه های داودی، در ترکیب هورمونی NAA با BAP و IAA با BAP گزارش شده است. در این بررسی ترکیب هورمونی IAA با Kin، تاثیر معنی داری در باززایی شاخساره نداشته است.

1-2- مرحلة فیزیولوژیکی گیاه و زمان کشت

ریزنمونه های جوان ساقه داودی (تهیه شده از گیاه 9 هفته ای) در مقایسه با ریز نمونه های مسن تر (تهیه شده از گیاه 19 هفته ای) تولید شاخساره بیشتری در محیط کشت نشان میدهند. علاوه بر این باززایی شاخساره ریزنمونه های تهیه شده در فصل زمستان در مقایسه با بهار و تابستان بیشتر می باشد.
برای بررسی زمان کشت، مریستم انتهایی داودی بطور ماهیانه، در فاصله بین مهر تا اردیبهشت در شرایط آزمایشگاهی مورد کشت قرار گرفت و مشاهده شد که استقرار ریز نمونه های تهیه شده بعد از مهر ماه کاهش نشان می دهد بطوریکه در دی ماه به کمترین میزان خود می رسد. استقرار ریز نمونه های تهیه شده در فاصله بین فروردین تا اردیبهشت عموماً‌ 100 درصد می باشد. همچنین در سرعت رشد ریز نمونه های تهیه شده در فصل بهار یک افزایش تدریجی مشاهده می شود. باززایی آن دسته از ریز نمونه های انتهایی ساقه داودی که در فاصله بین فروردین تا اردیبهشت ماه تهیه و کشت شده بودند، فاقد مرحله کالزایی نشان داده شد، در حالی که ریز نمونه های تهیه شده در زمانهای دیگر، اغلب مرحله کالزایی نیز نشان می دادند.

1-3- اثر نور و دما

در مورد کشت بافت داودی، همواره استفاده از نور لامپ فلورسنت سفید در یک تیمار نوری 16 ساعت روشنایی به همراه 8 ساعت تاریکی توصیه شده اشت. البته در بعضی موارد گزارشاتی مبنی بر استفاده از 15 ساعت روشنایی به همراه 9 ساعت تاریکی نیز وجود دارد. شدت نور مورد استفاده نیز بین 3000 تا 4000 لوکس گزارش شده است.
در اغلب گزارشات، دمای مورد نیاز برای رشد و نمو ریزنمونه ها ی در داودی، 22 تا 26 درجه سانتیگراد ذکر شده است.

2- کشت مریستم و تولید گیاه عاری از ویروس

اعمال تیمار گرمایی 38-35 درجه سانتیگراد بر روی گیاهان داودی در شرایط گلخانه ای به مدت 4 الی 37 هفته و سپس کشت مریستم منجر به تولید داودی های عاری از ویروسهای virusB, vein mottle, greenflower aspermy, stunt شده است. مقایسه تولید گیاهچه های عاری از بیماری از ریزنمونه های مریستم در دو حالت پیش تیمار گرمایی (37 درجة سانتیگراد به مدت 8 هفته) و بدون پیش تیمار گرمایی از جوانه های جانبی
(lateral shoot) با طول 4/0- 5/0 میلی متر و روی محیط MS تغییر یافته صورت گرفت و مشاهده شد که مریستم های حاصل از تیمار گرمایی رشد سریعتر و بقاء بهتری نشان می دهند. 93% از مریستم هایی که تیمار گرمایی دیده بودند شروع به پر آوری کردند در حالی که این میزان در مریستم های تیمار نشده 6/83% بود. همچنین ریشه زایی در شاخساره های حاصل از گیاهان تیمار شده خیلی زودتر شروع گردید. گیاهچه های ریشه دار شده به گلدانهای حاوی پیت موس و پرلایت منتقل شدند.

3- جنین زایی سوماتیکی

تولید جنین های سوماتیکی داودی در ریزنمونه های برگ 12 رقم از مجموع 23 رقم مورد بررسی روی محیط MS حاوی 2,4-D و BA مشاهده گردید اما فقط باززایی 5 رقم موفقیت آمیز بود.
همچنین جنین زایی سوماتیکی از ریزنمونه های گلبرگهای شعاعی Dendranthema grandiflorum kitamura روی محیط MS حاوی غلظتهای بالای IAA و Kinetin صورت گرفت. در این آزمایش استفاده از NAA منجر به جنین زایی گردید اما استفاده ازIBA و 2,4-D بر روی جنین زایی تاثیری نداشت. سیتوکنین های BAP و Thidiazuron نیز در ایجاد جنین زایی مؤثر نبودند. همچنین در غلظتهای پایین IAAهمراه با Kinetin و غلظتهای مختلف BAP جنین زایی صورت نگرفت. البته در غلظتهای بالای BAP تعداد زیادی شاخساره نابجا تولید گردید. در ریزنمونة برگ، هیچ کدام از ترکیبات تنظیم کننده های رشد مورد استفاده، منجر به جنین زایی نگردید.
جنین زایی سوماتیکی ریز نمونه های برگ داودی تحت تاثیر دو فاکتور نور و ساکارز، بر روی محیط اصلاح شده موراشیگ و اسکوگ (MSB) حاوی 1 میلی گرم بر لیتر 2,4-D به همراه 2/0 میلی گرم بر لیتر BA، مورد مطالعه قرار گرفت و مشاهده شد ریز نمونه هایی که بر روی محیط حاوی 9 تا 18 درصد ساکارز، در شرایط 28 روز تاریکی در ابتدا و به دنبال آن 10 روز روشنایی و برگشت دوباره آن به 14 روز تاریکی قرار می گیرند جنین زایی نشان می دهند. بیشترین میزان جنین زایی، در غلظتهای 12 تا 15 درصد ساکارز مشاهده می شود و غلظتهای کمتر ساکارز عمدتاً بر روی نمو ریشه و شاخساره ها موثر می باشند.